Gentransfektion

Vid överföring av gener från människa till plasmid (vektor) till slutmålet, hur selekterar man fram de plasmider som lyckats ligera genen från dem som misslyckats? Man kan ju ta fram de celler som tagit upp plasmiden genom att behandla med ett antibiotikum mot vilket plasmiden innehåller en resistensgen, men hur gör man egentligen för att selektera för lyckad ligering?

Om slutmålet = en bakterie kan man iaf använda blå/vit-screening.

Kortfattat kan man säga att genen LacZ används för att bryta ner en sockervariant hos bakterier (kanske bara hos E.coli?) vid namn x-gal. Vid lyckad ligering kommer LacZ genen förstöras vilket förhindrar nedbrytningen av x-gal. När x-gal bryts ner bildas ett blått ämne, vilket leder till att hela bakterien blir blå. Så vid lyckad ligering blir bakterien vit och man får sen själv flytta vita kolonier och odla upp.

Finns mer på wikipedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon

Blå/vit screening är en variant. En annan är att överföra kolonier till ett nylonfilter, och sedan hybridisera filtret med en sond för det genetiska materal man vill ligera in. Då selekterar man inte bara för lyckad ligering, utan också för lyckad ligering av rätt material. Vita kolonier kan det ju faktiskt bli också av en ren självligering av vektorn, t ex om man har fått de utstickande ändarna nedbrutna, så att man får en läsramsförskjutning i LacZ-genen.

Den gamla klassiska varianten från sjuttiotalet var att använda en plasmid med resisitensgener för två olika antibiotika, och sedan ligera in insertet i den ena resisitensgenen. Då selekterade man först positivt för den ena antibiotikaresistensen för plasmidupptag, och sedan negativt för den andra för närvaro av insert.

Det här verkar ju vara samma princip som blå/vit screening, men med en annan mekanism. Men hur fungerar den negativa selektionen - är det en gen som gör bakterien antibiotikakänslig som inaktiveras av ligering, eller är det en resistensgen som aktiveras (jag har inte tidigare hört talas om aktivering genom ligering)? Eller odlade man helt enkelt hela plattor av kloner från enskilda kolonier och testade för antibiotikakänslighet (resistensinaktivering genom lyckad ligering) för att kunna klassa ursprungskolonierna som lyckade ligeringar?

Man har helt enkelt sin plasmid med två antibiotikaresistensgener. I ena antibiotikaresistensgenen sitter en polylinker (MCS) där du sätter in din insert. Ifall insert har lyckats så slutar en antibiotikaresistensgenen att fungera.

D.v.s. du får in plasmiden i din bakterie. Du odlar upp din bakterie på det antibiotikumet som inte påverkas av inserten. Därefter kan du ta olika kolonier som växt upp där och odla upp på en platta med det antibiotikum som bakterien inte längre är resistent mot (vid lyckad insert). Ifall det inte växer upp något = lyckad insert.

_____________________
En annan metod som baserar sig på genotypisk screening som används ibland är: att du odlar upp dina bakterier på en platta. Överför dem (inte allt då) till ett nylonfilter. Där lyserar du cellerna och tillsätter väldigt stark bas (göra DNA enkelsträngat). Skölja filtret, vilket leder till att DNAt kommer bara vara kvar.

Därefter tillsätter du oligonukleotider som du märkt in på något vis (t.ex. radioaktivitet eller fluoroscens). Inkubera nylonfiltret med oligonukleotiderna vid lämplig temperatur. Där då oligonukleotiderna lyckats hybridisera med ditt DNA, där har du fått en lyckad insert. Dessa kolonier och de runt om brukar då tas ut och man kör hela proceduren en gång till för att försäkra sig om att det inte rör sig om icke-specifika inbindningar (sänka temperatur till nästa omgång t.ex.).

/ negative.creep