Extrahera specifika gener ur genom?

Hur gör man för att extrahera en specifik gen ur ett genom, utan att få med vare sig andra gener från samma organism eller gener från andra organismer? Jag frågar nu inte efter PCR som följer efteråt utan hur man urskiljer den enskilda genen som ska replikeras. Hur går det till?

Ja, att det används enzymer för att dela genomet i mindre bitar vet jag (är dock intresserad av hur man får tag på sådana vilket jag inte vet). Men hur gör man dels för att få ut specifika gener och inte bara en röra av alla möjliga gener, dels för att få generna hela och inte klyva dem itu med enzymerna?

Lite oklart vad du menar. Varför fungerar inte PCR med primers för den gen du vill åt?

Eller menar du att genens sekvenser är helt okända?

Nej, genen är känd. Men räcker det verkligen att bara använda primers för att förhindra att PCR även masskopierar icke avsedda gener i provet? Var får man i så fall tag på sådana primers för specifika gener?

Jag är alltså ute efter att kunna masskopiera en specifik gen utan att andra, kontaminerande gener masskopieras med den. Renframställning med andra ord.

Tja, finns det andra sekvenser som börjar och slutar med dina primers, så är det klart att de kommer kopieras de med. Därför vill man ha så specifika primers som möjligt. Vanligtvis anses väl 20-22 baspar vara tillräckligt. Primers beställer man från en leverantör som specialiserar sig på primers. Primers kan tillverkas efter specifikation. Detta förutsätter förstås att vet något om sekvensen som ska kopieras (så man kan specificera primers), annars blir det ju svårt med den metoden.

Vad vill du använda slutprodukten till, dvs, vad är syftet med extraktionen?

Vill du ha hela genen, med intron, exon och icke-kodande delar?
Designa primers som mappar genen,

Vill du bara ha de delar av genen som innehåller de för proteinet kodande delarna (exonerna):
Lätta sättet: Köp färdigt cDNA
DIY: extrahera mRNA, inkubera med reverst transkriptas, ligera in ditt cDNA in i minimal backbone, transformera bakterier, och sen en colony pcr följt av Sanger. Därefter odlar du upp den koloni som innehåller den rätta sekvensen utan errors och kan enkelt använda restriktionsenzymer för att ligera in i ett annat backbone om du så önskar.

Tänk på olika isoformer av proteinet så du får det rätta för ditt ändamål.

Vill i alla fall ha med det som reglerar genaktiviteten i tillägg till det proteinkodande, medan det som inte har någon för sekvensen specifik funktion alls inte är så viktigt även om det ärvs länkat till genen på grund av var det sitter. Fungerar DIY för de kraven, och behövs särskilda sätt att göra det för att få de resultaten?

Räcker 20-22 baspar för att få med det som reglerar genens aktivitet eller bara för den proteinkodande delen? Jag syftar på faktiskt påvisad reglering av genens aktivitet, inte trångsynta påståenden om att allt DNA som inte kodar för proteiner "måste" ha en reglerande funktion. Att en del icke-kodande DNA har funktioner utesluter inte att det även kan finnas riktigt skräp utan funktion.

Jag skulle säga att det är helt omöjligt att svara på utan att känna till vilken gen och vilka regulatoriska element du avser, och vad syftet med det hela är. Så vill du bara ha den kodande sekvensen (exonerna) samt regulatoriska element så blir det svårt. Kan ge dig ett mer utförligt svar om jag får mer info.

Det gör inget om det följer med lite DNA utan funktion också om extraktionen blir lättare då, till exempel genom att det sitter mellan det kodande och det regulatoriska elementet. Om vi börjar med exemplet en gen för självlysning, vad krävs då?

Nu är jag ju inte bara ute efter självlysning, det är ett exempel. Går det att säga något generellt om vad för typ av utrustning det krävs för att extrahera DNA av den och den storleken och den och den fördelningen i genomet (i ett block respektive uppdelat på flera platser)?